(Revogado pela Instrução Normativa MAPA Nº 30 DE 26/06/2018):

O Ministro de Estado da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, no uso da atribuição que lhe confere o art. 87, parágrafo único, inciso II, da Constituição, tendo em vista o disposto no Decreto nº 5.351, de 21 de janeiro de 2005, no Decreto nº 30.691, de 29 de março de 1952, no Decreto nº 5.741, de 30 de março de 2006, na Instrução Normativa MAPA nº 1, de 16 de janeiro de 2007, e o que consta do Processo nº 21000.011757/2009-45,

Resolve:

Art. 1º Aprovar o Método Oficial de Determinação de CMP (caseinomacropeptídeo) em leite, por HPLC, Eletroforese Capilar e Espectrometria de Massas em leite, em apresentações integrais, semi-desnatadas e desnatadas, tratados por processos de UHT ou pasteurização, na forma do Anexo à presente Instrução Normativa.

Art. 2º O método de que trata esta Instrução Normativa será adotado pelos laboratórios pertencentes à Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários do Sistema Unificado de Atenção à Sanidade Agropecuária.

Art. 3º Esta Instrução Normativa entra em vigor na data de sua publicação.

REINHOLD STEPHANES

ANEXO - MÉTODO OFICIAL DE DETERMINAÇÃO DE CMP (CASEINOMACROPEPTÍDEO) EM LEITE

1. Escopo

O CMP é um peptídeo específico do soro de queijo, sendo o fragmento terminal da k-caseína. Este peptídeo é liberado quando o leite é tratado com quimosina durante o processo de produção dos queijos. A k-caseína é hidrolisada em dois peptídeos. O menor deles, o CMP, tem peso molecular aproximado de 7-8 Kd. Sendo um componente específico do soro de queijo, a determinação de CMP em leite pode ser utilizada como um marcador para a adulteração deste produto por adição de soro.

O presente método foi validado para a determinação de CMP em amostras de leite fluido e em pó, em apresentações integrais, semidesnatadas e desnatadas, tratados por processos de UHT ou pasteurização. Permite a diferenciação entre o CMP proveniente de soro de queijo e peptídeos similares produzidos por proteólise bacteriana do leite, que são denominados genericamente de "pseudo-CMP", além da quantificação do CMP.

Os Limites de Detecção (LD) e de Quantificação (LQ) definidos em procedimentos de validação intralaboratorial, bem como os Limites Aceitáveis (LA) de CMP, são estabelecidos pelo DIPOA.

2. Fundamentos

A configuração de marcha analítica adotada envolve uma primeira etapa de separação dos picos por cromatografia líquida de exclusão molecular (SEC), que permite uma análise de triagem com aplicações semiquantitativas, seguida da coleta das frações de interesse para as amostras consideradas positivas, purificação e digestão tríptica dos compostos isolados e análise discriminatória e quantitativa por eletroforese capilar (EC). A prova definitiva da estrutura molecular dos compostos será realizada pelas técnicas de digestão tríptica e caracterização dos fragmentos característicos de cada composto por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). Ressalta-se que a etapa de EC pode ser suprimida, sendo, neste caso, as amostras positivas na triagem confirmadas diretamente por LC -MS/MS.

2.1. Composição do lote

Para cada lote de análise, deve-se preparar uma curva de calibração de, no mínimo, três pontos (triagem por SEC) ou de, no mínimo, cinco pontos (quantificação, EC ou LC -MS/MS). Amostras de CMP dissolvido em solvente (ver item 6.2.2) são analisadas em duplicata (no mínimo), para cálculo da recuperação. As amostras desconhecidas são analisadas em uma única alíquota por SEC. Amostras positivas devem ter suas identidades confirmadas e serem quantificadas com, no mínimo, três replicatas pelos métodos de EC e LCMS/MS. Cada lote também deve ser acompanhado de uma amostra branca.

3. Reagentes, padrões e materiais

Todas as substâncias químicas e solventes utilizados são de grau analítico exceto onde está especificado. Água deionizada ou duplamente deionizada deve ser usada durante todo o trabalho.

Método de triagem (SEC)

. Ácido fosfórico.

. Ácido tricloroacético (TCA)

. Cloreto de sódio

. Dihidrogenofosfato de potássio (KH2PO4)

. Hidrogenofosfato de potássio (K2HPO4)

. Hidróxido de potássio p.a.

. Leite cru (preferencialmente recém-ordenhado)

. Sulfato de sódio anidro

. Padrão de CMP (Davisco Foods ou similar)

Método de quantificação (EC)

. Fluorescamina

. Tetraborato de sódio (Na2B4O7.12H2O)

. Ácido bórico

. Acetona

. â-Ciclodextrina

. Hidróxido de sódio

. Tripsina de pâncreas suíno (CAS 9002-07-7) com aproximadamente 1500U.mg-1

. Bicarbonato de amônio

Método de quantificação e/ou confirmação (LC-MS/MS)

. Acetonitrila

. Ácido acético glacial

. Ácido trifluoroacético

4. Equipamentos

Método de triagem (SEC)

. Barras magnéticas de 2,5-3,0 cm aproximadamente

. Bureta (preferencialmente, de 50 mL)

. Copo de béquer de vidro ou plástico (ou frasco similar) de 50, 100 ou 150 mL (para amostras)

. Frascos de injetor automático com volume de 1,5-2,0 mL

. Funil de vidro

. Papel de filtro qualitativo Whatman nº 4 ou nº 5 ou similar

. Suporte para funis

. Agitador magnético com aquecimento

. Centrífuga refrigerada

. Homogeneizador tipo vórtex

. Pipetas de Pasteur descartáveis

Método de quantificação (EC)

. Copo de béquer de vidro ou plástico (ou frasco similar) de 50, 100 ou 150 mL (para amostras)

. Microtubos tipo Eppendorf ou similar, volumes de 1,5 ou 2,0 mL

. Vidraria comum de laboratório para preparo de soluções

. Micropipeta para faixa de volume de 100-1000 ìL

. Unidades filtrantes descartáveis com filtros de 0,22 ou 0,45 ìm para soluções aquosas tipo Millipore ou similar

. Banho de gelo

Método de quantificação e/ou confirmação (LC-MS/MS)

. Frascos de injetor automático com volume de 1,5 ou 2,0 mL

. Micropipeta para faixa de volume de 100-1000 ìL

5. Precauções analíticas

Este método envolve o uso de substâncias químicas nocivas e procedimentos que apresentam risco ao operador. Roupas de proteção, incluindo jaleco (abotoado e de mangas longas), óculos e luvas de segurança devem ser utilizados durante todo o processo. Solventes orgânicos somente podem ser manipulados em ambientes com exaustão adequada. Amostras de alimentos em geral devem ser considerados de risco biológico, evitando-se o contato direto com a pele e mucosas.

6. Procedimentos

6.1. Preparo de Soluções

6.1.1. TCA 24%

Pesar 120 g de TCA e diluir com água d/d para um volume de 500 mL. Esta solução deve ser preparada nova para cada lote de análises.

6.1.2. Solução-padrão estoque de CMP (1 mg.mL-1)

Pesar 0,05 g de CMP e diluir em balão de 50 mL com tampão borato 20mM pH 10 (diluir o padrão com 25 mL de tampão borato 40mM e levar a volume de 50 mL com água). Esta solução deve ser mantida refrigerada até o momento de uso, sendo estável por 1 mês nestas condições. Para uso imediato, o solvente pode ser água d/d. Concentração final da solução: 1 mg.mL-1. Considerando pureza de 97% e peso molecular de ± 6700 Da, a molaridade desta solução é de aproximadamente 72,5 ìM de CMP.

6.1.3. Solução da fase móvel tampão pH 6,0 para SEC

Dissolver 1,74g de hidrogenofosfato de potássio (K2HPO4), 12,37g de dihidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) e 21,41 g de sulfato de sódio anidro (Na2SO4) em aproximadamente 700 mL de água; ajustar o pH da solução em 6,0, usando solução de ácido fosfórico (H3PO4) 1M ou solução de hidróxido de potássio (KOH) a 50 % (m/v). Completar o volume para 1000mL com água, filtrar a solução em membrana de 0,45 ìm.

6.1.4. Solução de ácido fosfórico (H3PO4) 1M

Transferir 2 mL de ácido fosfórico concentrado para balão volumétrico de 100 mL contendo 50 mL de água. Esfriar e completar o volume.

6.1.5. Solução de hidróxido de potássio (KOH) a 50 % (m/v)

Dissolver 50 g de hidróxido de potássio com 50 mL de água.

6.1.6. Solução de bicarbonato de amônio 50 mM

Dissolver 0,79 g de bicarbonato de amônio em 200 mL de água d/d.

6.1.7. Solução-estoque de tripsina (200 ìg.mL-1)

Dissolver 20 mg de tripsina em 100 mL de ácido acético 50 mM. Esta solução é estável até 1 mês sob refrigeração. Diluir 10 vezes para o uso com a solução de bicarbonato de amônio 50 mM. Fazer as diluições sempre em banho de gelo.

Por exemplo, para solução com 1 mg de CMP por mL, usar 1 mL de solução diluída de tripsina para obter uma razão enzima: substrato de 1:50. Para as análises em LC -MS/MS, o produto de digestão pode ser diluído até 1000 vezes, dependendo da concentração predita pelo método de triagem e das diluições prévias.

6.1.8. Solução tampão de tetraborato de sódio (borato 40 mM)

A solução A é preparada pela dissolução de 3,81g de tetraborato de sódio dodecahidratado (PM=381,37) em 1000 mL de água d/d. Esta solução possui molaridade de 10 mM de Na2B407*12H20, o que corresponde à 40 mM de borato. A solução B é preparada pela dissolução de 2,48 g de ácido bórico (PM=61,83) em 1000 mL de água d/d. Esta solução possui molaridade de 40 mM de H3BO3 Para o preparo do tampão, adicionar solução B na solução A até o pH desejado. Se necessário, utilizar NaOH 100 mM para ajuste.

6.1.9. Eletrólito (BGE) para eletroforese capilar (tampão borato 20 mM - pH 10,0)

Diluir a solução tampão de borato 40 mM pH 10,0 com água d/d. Filtrar em unidade filtrante descartável com membrana de 0,22 ìm.

6.1.10. Fase móvel LC -MS/MS

Solvente A - Acetonitrila e ácido trifluoroacético (CH3CN + 0.05% TFA); Solução B - Água d/d (H2O + 0.05% TFA). A eluição é realizada com um gradiente linear de solvente B em A de 35% a 55% por 30 minutos.

6.1.11. Solução de fluorescamina 20 mM

Dissolver 1,1 g de fluorescamina em acetona PA e levar à volume em balão volumétrico de 200 mL.

6.2. Preparo de amostras

6.2.1. Precipitação das amostras de leite fluido ou leite em pó reconstituído e das amostras de curva de calibração.

Pipetar, para um copo de béquer ou frasco similar, 10 Ml de leite.

. Adicionar lentamente, com auxílio de uma bureta, 5 mL de solução de TCA 24%, sob agitação constante.

. Deixar em repouso por 60 ± 5 minutos em temperatura ambiente.

. Filtrar por filtro de papel, descartando as primeiras gotas do filtrado.

. O filtrado é injetado diretamente no sistema de HPLC ou sofre purificação posterior.

. Se necessário, filtrar por membrana de 0,45 ìm antes da injeção, quando a amostra se apresentar turva.

6.2.2. Curva de calibração

A curva de calibração é feita em matriz, isto é, alíquotas de amostra branca (leite cru recém-ordenhado) fortificadas conforme Tabela 2. Deve-se proceder à fortificação dispensando diretamente sobre amostra branca o volume apropriado da solução de fortificação, agitando suavemente e deixando em repouso por aproximadamente 15 minutos.

Tabela 2. Preparação da curva de calibração em matriz.

Observação: a mesma curva pode ser usada para curva de produtos de digestão para análise em LC -MS/MS, levando em conta a diluição que deve ser realizada.

6.2.3. Preparação de amostras fortificadas para avaliação da recuperação

Em copo de béquer ou frasco, adicionar 19 mL de leite "branco" (sabidamente ausente de CMP e/ou pseudo-CMP) e 1 mL de solução-padrão estoque (1mg.mL-1). A concentração nominal desta amostra é de 50 ìg.mL-1 e o cálculo da recuperação deve ser feito comparando a área do pico de CMP desta amostra com a do ponto 2 da curva, que também possui concentração nominal de 50 ìg.mL-1.

A figura 2 abaixo sintetiza o modo de preparo de amostras, padrões e recuperados.

Figura 2. Modo de preparação de amostras, curva de calibração e amostras tipo matrix matched.

6.2.4. Purificação complementar

Esta etapa é opcional e só foi utilizada com finalidade de desenvolvimento e pesquisa, não sendo utilizada na validação dos métodos.

O filtrado final tem uma concentração aproximada de 8% de TCA, onde o CMP e outros pequenos peptídeos se encontram em solução. Nas análises em HPLC, a injeção das amostras neste solvente gera um pico muito intenso de TCA, pela leitura realizada em uma zona muita baixa do ultravioleta (205 nm), causando interferência na qualidade do cromatograma, embora elua após o CMP. Pode-se utilizar o seguinte protocolo de purificação:

. Em 10 mL do filtrado final, obtido no item 6.2.1, adicionar 2 mL de solução de TCA 50% para precipitar as proteínas que não foram desnaturadas na primeira etapa, incluindo o CMP.

. Manter as amostras entre 1-8ºC (refrigerador) durante aproximadamente 24 horas.

. Após, centrifugar por aproximadamente 10 minutos X 6000g e descartar o sobrenadante.

. Lavar o pellet com 5 mL de etanol:éter etílico (1:1)

. Repetir a etapa de centrifugação.

. Desprezar o sobrenadante deixando o tubo drenar para eliminação do solvente orgânico.

. Retomar o pellet no solvente adequado à finalidade analítica.

6.2.5. Coleta de frações

A coleta de frações de interesse, a partir da triagem por SEC, correspondentes ao pico eluído de CMP (ou pseudo-CMP) é realizada para as amostras positivas e pode ser realizada manualmente ou através de coletor de frações. A quantidade de injeções e coletas depende da aplicação posterior. Para análise em EC, coletar de 5 a 10 injeções da amostra suspeita. Para análise em LC -MS/MS, uma coleta é suficiente. Por exemplo, a coleta de um pico de padrão de CMP em solvente de concentração igual à 50 ìg.mL-1 (injetados 100 ìL) contém 5 ìg de CMP em cerca de 1 mL coletado.

6.2.6. Digestão tríptica das frações coletadas

. Calcular uma quantidade de enzima (tripsina) para uma razão equivalente à 1:50 (enzima:substrato); estimar a quantidade de CMP na amostra usando a curva injetada em SEC.

. Reconstituir a quantidade necessária de tripsina em solução de bicarbonato de amônio 25mM, imediatamente antes de adicionar às análises.

. Adicionar a quantidade calculada de solução de tripsina para cada amostra resultante da coleta das frações (o valor deve ser registrado para correção posterior de resultados).

. Agitar por 5-10 segundos cada tubo em vórtex.

. Incubar à 37±2 ºC por 4±0.5 hs, em microtubos selados, sob agitação (~400rpm).

. Como controle da digestão, digerir amostra de solução padrão equivalente à 50 mg.L-1.

. Para quantificação, digerir amostras de padrão em solvente, de modo a produzir uma "curva de calibração" de produtos de digestão tríptica, capaz de quantificar correlativamente CMP e/ou pseudo-CMP.

6.2.7. Derivatização das amostras para detecção por fluorescência induzida a laser

Realizar em microtubo a seguinte reação de derivatização:

. Adicionar 20 ìL de amostra purificada

. Adicionar 25 ìL de tampão borato 20mM pH 10,0

. Adicionar 45 ìL de água

. Agitar suavemente com a mão e deixar repousar o líquido novamente

. Adicionar 10 ìL de solução de fluorescamina 20 mM (em acetona)

. Agitar imediatamente e aguardar 3 minutos aproximadamente antes de aplicar a amostra no sistema de EC.

6.3. Detecção e quantificação

Método 1 (SEC): As amostras serão analisadas em sistema de cromatografia líquida de alta performance sob as condições de análise descritas na Tabela 3. A quantificação é realizada através do software LCsolution (Shimadzu) ou similar.

Tabela 3. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE

Método 2. (EC): As amostras serão analisadas em sistema de eletroforese capilar com detecção por fluorescência induzida à laser (Tabela 4) sob as condições de análise especificadas na tabela abaixo. A quantificação é realizada através da calibração com amostras padrão (para análise de CMP íntegro) e com digestão de soluções de padrão (para produtos de digestão tríptica).

Tabela 4. ELETROFORESE CAPILAR

Método 3. (LC-MS/MS): As amostras serão analisadas em sistema de cromatografia líquida de alta performance acoplada à espectrômetro de massas em modo tandem sob as condições de análise listadas na Tabela 5. A identificação e quantificação é realizada através do software Analyst (Applied Biosystems).

Tabela 5. HPLC - ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Tabela 6. Fragmentos ionizados de peptídeos resultantes da digestão tríptica de CMP

*fragmento de CMP (clivagem entre os AAs 105-106 da k-caseína)

**fragmento de Pseudo-CMP (clivagem entre os AAs 106 -107 da k caseína)

Tabela 7. Fragmentos ionizados de peptídeos resultantes da digestão tríptica de CMP

DP, potencial de "declustering"; CXP, potencial de saída; CE, energia de colisão

7. Resultados

Os resultados serão considerados da seguinte forma:

Método 1. (SEC) - amostras com pico na janela de tempo de retenção do CMP com áreas equivalentes ou inferiores ao pico do ponto de menor concentração da curva de calibração (25 mg.L-1) serão consideradas "negativas", ou seja, com teor de CMP dentro da quantidade aceitável para consumo direto. Amostras com picos com área equivalentes ou superiores ao ponto de menor concentração da curva serão consideradas "positivas" e serão analisadas nos métodos de EC e/ou LC -MS/MS para confirmação da identidade e para quantificação. Para tanto, a amostra positiva será reinjetada e os picos serão coletados para a digestão tríptica.

Método 2. (EC) - a EC permite a "abertura" do pico único evidenciado em SEC em múltiplos picos, correspondentes às isoformas do CMP (variantes genéticas A e B e suas múltiplas formas glicosiladas e/ou fosforiladas, bem como pseudo-CMP). A análise destes eletroferogramas proporciona informação estrutural sobre a composição do CMP presente na amostra positiva, sendo a quantificação realizada pela comparação dos picos principais em relação ao padrão. A derivatização do CMP íntegro ou de seus produtos de digestão tríptica amplia a capacidade de detecção do método, bem como a seletividade do mesmo. Se a análise dos eletroferogramas não for suficiente para determinar a natureza do peptídeo (CMP ou pseudo-CMP), é necessária a análise confirmatória por LC -MS/MS. Conforme descrito no item "Fundamentos", a análise por EC pode ser suprimida se estiver disponível o método de confirmação por LCMS/MS.

Método 3. (LC-MS/MS) - A confirmação da identidade do peptídeo na amostra suspeita é realizada pela identificação dos fragmentos terminais da k-caseína original, de modo que é possível determinar a massa molecular exata de cada fragmento. Embora seja possível a formação de CMP por ação de enzimas proteolíticas bacterianas, a especificidade da ação enzimática de Pseudomonas fluorescens é pela clivagem em 106-107. A análise por LC -MS/MS também pode se dar de forma quantitativa, no caso de não puder ser realizada por EC, através de calibração com digestão tríptica de amostras de padrão. A estrutura primária das variantes genéticas de CMP A e B, bem como o pseudo-CMP, está descrita abaixo (Figura 3), com o fragmento alvo da diferenciação em destaque (negrito).

CMP A

MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV

CMP B

MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVATLEASPEVIESPPEINTVQVTSTAV

Pseudo-CMP

AIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV

Figura 3. Estrutura primária de CMP A, CMP B e pseudo-CMP. Com a digestão tríptica, os analitos se convertem em peptídeos de 6 ou 7 aminoácidos, eliminando o problema da diversificação de isoformas glicosiladas e fosforiladas. Do mesmo modo, a variação de aminoácidos existente entre a variante genética A e B não é levada em conta, já que ambas variantes apresentam a mesma estrutura terminal.

7.1. Critérios de aceitabilidade dos resultados

7.1.1. Coeficiente de correlação (r) da curva de calibração

O coeficiente de correlação (r) da curva de calibração em matriz deve ser> 0,92 para SEC, caso contrário, a curva deve ser repetida. No caso de curvas de produtos de digestão, são considerados satisfatórios valores> 0,85.

7.1.2. Parâmetros de recuperação

Os dados de recuperação devem ser monitorados através de carta controle e, embora controlados, não estão envolvidos nos cálculos de concentração, uma vez que a curva é realizada em amostras de recuperado, mas se a recuperação não se mostrar satisfatória em relação à carta controle, deve-se realizar a análise crítica do processo.

7.2. Cálculos e emissão dos resultados

7.2.1 Deve-se calcular a concentração dos analitos nas amostras utilizando a seguinte equação, obtida pela injeção dos padrões da curva:

y = ax + b

onde: y = concentração em ìg.mL-1;

x = área do pico;

a = inclinação da reta;

b = intercepto y.

8. Referências

CAMPOS, T. M. (2008). "Desenvolvimento de método analítico para determinação diferencial de caseinomacropeptideo e pseudo-caseinomacropeptídeo em leite por LC -MS/MS". Projeto Tecnológico de Conclusão de Curso - Química Industrial. Instituto de Química, UFRGS.

DE NONI, I. and P. Resmini (2005). "Identification of rennet-whey solids in "traditional butter" by means of HPLC/ESI-MS of non-glycosylated caseinomacropeptide A." Food Chemistry v93, p65.

LORENZETTI, D. K. (2006) Dissertação "Influência do tempo e da temperatura no Desenvolvimento de microrganismos psicrotróficos no leite cru de dois estados da região sul". Curitiba, PR.

Método de Ensaio - MET RPM/05 - Determinação de CMP em leite por HPLC, eletroforese capilar e espectrometria de massas. Laboratório de Análises de Resíduos de Pesticidas e Medicamentos Veterinários (RPM) - Laboratório Nacional Agropecuário (LANAGRO/RS) Emissão: 16/04/2009. Versão 1.

RECIO, I., L. AMIGO, et al. (1997). "Application of capillary electrophoresis to the study of proteolysis of caseins." Journal of Dairy Research v64 (2), p221.

RIEL, V. J. and OLIEMAN, C (1995). "Determination of caseinomacropeptide with capillary zone electrophoresis and its application to the detection and estimation of rennet whey solids in milk and buttermilk powder." Electrophoresis v16 (4), p529.

THOMA, C., I. Krause, et al. (2006). "Precipitation behaviour of caseinomacropeptides and their simultaneous determination with whey proteins by RP-HPLC." International Dairy Journal v16, p285.